PERCOBAAN IX
I. Judul :
Kromatografi Lapis Tipis
II. Hari/Tanggal : Jum’at, 03 Mei 2013
III. Tujuan : Memahami tekhnik-teknik dasar
kromatografi lapis tipis
IV. Landasan Teori
Kromatografi
adalah suatu metode pemisahan fisik, dimana komponen yang dipisahkan
terdistribusi dalam 2 fase. Salah satu fase tersebut adalah suatu lapisan
stasioner dengan permukaan yang luas yang lainnya seperti fluida yang mengalir
lembut disepanjang landasan stasioner. Ketika pita tersebut melewati kolom,
pelebaran disebabkan oleh rancangan kolom dan kondisi pengerjaan dan dapat
diterangkan secara kuantitatif dengan pengertian jarak dengan teori kolom
adalah jantung kromatografi, pemisahan sesungguhnya komponen dicapai dalam
kolom.
(
Underwood.2006 : 487 )
Dalam teknik
kromatografi campuran, senyawa dapat dipisahkan menjadi komponennya berdasarkan
pendistribusian zat antara 2 fase, yaitu fase diam(stasioner) dan fase gerak
(mobil). Azas penting dalam kromatografi adalah bahwa senyawa yang berbeda
mempunyai koefisien distribusi yang berbeda. Senyawa yang berinteraksi lemah
dengan fase diam akan bergerak lambat. Idealnya, setiap komponen dalam campuran
senyawa bergerak dengan laju yang berbeda dalam system kromatografi, sehingga
untuk analisis kuantitatif dan kualitatif. Istilah presfektif merujuk pada
pemisahan dalam skala besar yang menghasilkan pemisahannya dapat digunakan
lebih lanjut. Sebagian bahan penjerap digunakan silika gel (SiO2.H2O)
atau alumina terhidrasi (Al2O3). Permukaan bahan ini
memiliki kemampuan untuk menjerap senyawa organic. Umumnya semakin polar
senyawa organic ditandai dengan gugus fungsi karbonil, nitril, hidroksil,
amino, karboksilat, dll. Semakin kuat ia menjerap molekul air, sehingga
kereaktifannya menurun.
( Tim Kimia Organik.2013 : 38 )
Kromatografi lapis tipis merupakan cara pemisahan campuran
senyawa menjadi senyawamurni dan mengetahui kuantitasnya yang menggunakan
kromatografi juga merupakan analisis cepat yang memerlukan bahan sangat sedikit, baik menyerap maupun
merupakan cuplikan KLT dapat digunakan untuk memisahkan senyawa-senyawa yang
sifatnya hidrofilik seperti lipid-lipid dan hidrokarbon yang sukar dikerjakan
dengan kromatografi kertas. KLT juga dapat digunakan untuk mencari kromatografi
kolom, identifikasi senyawa secara kromatografi dengan sifat kelarutan senyawa
yang dianalisis. Bahan lapis tipis seperti silika gel adalah senyawa yang tidak
bereaksi dengan pereaksi-pereaksi yang lebih reaktif seperti asam sulfat.
( Fessenden, 2003 )
Kromatografi
lapis tipis atau TLC(Thin layer
chromatography) seperti halnya kromatografi kertas, murah dan mudah
dilakukan. Kromatografi ini mempunyai satu keunggulan dari segi kecepatan dan
kromatografi kertas. Kromatografi lapis tipis membutuhkan hanya setengah jam
saja, sedangkan pemisahan yang umum pada kertas membutuhkan waktu beberapa jam.
TLC sangat terkenal dan rutin digunakan di berbagai laboratorium. Media
pemisahannya adalah lapisan dengan ketebalan sekitar 0,1-0,3 mm zat padat
adsorben pada lempeng kaca, plastic dan aluminium. Lempeng yang paling umum
digunakan yang berukuran 8x2 inchi. Dan zat padat yang digunakan adalah
alumina, TLC kadang-kadang disebut dengan kromatografi planar. Tidak ada cara
yang mudah dalam mengelusi komponen sampel dari lempengan (kertas) untuk
melintasi sebuah detektor tetapi telah dikembangkan peralatan untuk mengamati
lempengan dengan sifat-sifat sampel seperti itu adsorpsi sinar UV dan
pengedaran.
(
Undewood. 2002 : 551 )
Pertimbangan
untuk pemilihan pelarut pengembang (aluen) umumnya sama dengan pemilihan eluen
untuk kromatografi kolom. Dalam kromatografi adsorpsi, pengelusi eluen naik
sejalan dengan pelarut (misalnya dari heksana ke aseton, ke alkohol, ke air).
Eluen pengembang dapat berupa pelarut tunggal dan campuran pelarut dengan
susunan tertentu. Pelarut-pelarut pengembang harus mempunyai kemurnian yang
tiggi. Terdapatnya sejumlah air atau zat pengotor lainnya dapat menghasilkan
kromatogram yang tidak diharapkan.
KLT merupakan
contoh dari kromatografi adsorpsi. Fase diam berupa padatan dan fase geraknya
dapat berupa cairan dan gas. Zat
terlarut yang diadsorpsi oleh permukaan partikel padat. Kromatografi adsorpsi
memiliki beberapa kekurangan, yaitu : a. pemilihan fase diam(adsorben), b.
koefisien distribusi untuk seringkali tergantung pada kadar total, sehingga
pemisahannya kurang sempurna.
( Soebagio,dkk. 2002 : 58-88 )
Secara teori,
pemisahan kromatografi yang baik akan diperoleh jika fase diam mempunyai luas
permukaan sebesar-besarnya sehingga terjadi kesetimbangan yang baik antara
fasegas dan fase diam. Persyaratan kedua agar pemisahan baik adalah fase gerak
bergerak dengan cepat sehingga difusi menjadi sekecil-kecilnya.
( Gritter etal . 1991 )
V. Alat dan Bahan
ALAT : BAHAN:
·
Pelat pipa
kecil ●
Aquades
·
Oven pengering ●
Metanol
·
Kain kering ●
Bubur silika
·
Kaca besar ●
CH3COOH
·
Pita selotip ●
Benzena
·
Penggaris ●
Eter
·
Gelas piala ●
Kertas saring
·
Cawan petri ●
Tablet Kafein
·
Tabung reaksi ●
Kristal Iod
·
Pipa gelas
kapiler ●
Sampel daun
·
Pensil lunak ●
PE
·
Lumpang ●
Na2SO4 anhidrat
·
Pipet tetes ●
Selulosa
·
Glass wool ●
CaCO3
·
Stopwatch ●
Sukrosa
·
Plat TLC ●
Aseton
·
Rotavor ●
Pita berwarna
VI. Prosedur Kerja
A.
Kromatografi
Lapis Tipis
1.
Penyiapan Plat
Pelat kaca kecil
→ dibersihkan
→ dilap dengan kertas
→ dikeringkan dalam oven
5 pelat
→ disusun diatas kaca besar
→ direkatkan
kedua sisi
Silika gel
→ disiapkan
→ disebarkan
suspensi
→ dikeringkan
pelat dalam
Hasil
2.
Penyiapan
Bejana
Larutan pengembang
→ dibuat dengan
komposisi (methanol: asam asetat: eter: benzena
= 0,1:1:3:5:9)
→ dilapisi
dengan kertas saring
→ ditutup gelas
kimia dengan cawan petri
Hasil
3.
Penyiapan
Contoh
Tablet mengandung kafein
→ digerus
→ diekstrak
dengan 5 ml etanol
→ dilarutkan
dalam 1 ml etanol
→ diambil
dengan pipa gelas kapiler
→ dibubuhkan
diatas titik kecil
→ dikeringkan
nodanya
→ dibubuhkan
sampai 3-5 kali
Hasil
4.
Pengembangan
P e l a t
→ dimasukkan
dalam pipa bejana pengembang
→ dijaga noda
agar tidak terendam
→ dibiarkan
sampai garis dalam pelarut sampai 1cm dari tepi atas pelat
→ diangkat dari
bejana dan ditandai garis depan
→ dikeringkan
dan dimasukkan dalam gelas kimia berisi kristal Iod
→ ditunggu
sampai pelat menampakkan noda
→ diangkat dan
ditandai dengan pensil
→ dihitung dan
dibandingkan Rf yang diperoleh
Hasil
B.
Kromatografi
Kolom
1.
Penyiapan Daun
Daun
→ dilumatkan
dengan lumpang
→ direndam
selama 1 jam dengan campuran 90ml PE, 10ml Benzena, 30
ml metanol
→ disaring
dengan air 4x
Lapisan organik
→ dipisahkan
dan dikeringkan dengan kristal Na-
sulfat anhidrat
→ disaring dan
dipekatkan dengan rotavator
Hasil
2.
Penyiapan Kolom
Kolom Kromatografi
→ disiapkan
dengan pipet tetes
→ disumbat
bagian bawah dengan gelas woll
→ dimasukkan
suspensi selulosa sampai 3-4 cm
→ dimasukkan
suspensi CaCO3, kemudian suspensi sukrosa
Pelarut
→ ditambahkan
terus menerus
Timbunan penyerap
→ diletakkan
guntingan kertas saring
Hasil
3.
Kromatografi
Larutan sampel
→ dimasukkan
setelah permukaan pelarut menurun
→ dibilas
bagian dalam kolom dengan campuran PE : aseton saat telah
mendekati permukaan penjerap
Pemisahan
→ dilihat dari
sejumlah pita berwarna
Tetesan
→ ditampung
dengan tabung reaksi
→ dipisahkan
berdasarkan warnanya
Pelarut
→ dihentikan
pemberiannya bila semua warna telah keluar dari kolom
Hasil
VIII. Data Pengamatan
Panjang pelat = 5 cm
Lebar pelat = 1 cm
Batas atas dan bawah = 0.5 cm
Tipe pelat = F254
|
Pelarut
|
Perbandingan
|
Rf
|
|
Butanol : asetat : eter :
benzena
|
1 : 1 : 1 : 1
: 4
|
Rf = 0,76
|
|
Eter : metanol
|
1 : 1
|
Rf = 0,875
|
|
Benzena : CH3COOH
|
2 : 1
|
Rf = 0,75
|
|
Metanol : benzena
|
1 : 3
|
Rf = 0,925
|
|
Eter : CH3COOH
|
2 : 3
|
Rf = 0,7
|
|
Metanol : CH3COOH
|
1 : 3
|
Rf = 0,875
|
|
Eter :
benzena
|
1 : 2
|
Rf = 0,7
|
VIII. Pembahasan
Pada praktikum
kali ini, kami melakukan percobaan dengan menggunakan Kromatografi Lapis Tipis.
Kromatografi
lapis tipis atau TLC, seperti kromatografi kertas, tidaklah mahal dan mudah
menggunakannya. Dibandingkan dengan kromatografi kertas lebih cepat. Prosesnya
mungkin memerlukan hanya sekitar setengah jam, sedangkan pemisahan yang lazim
pada kertas memerlukan beberapa jam. TLC sangat populer dan secara rutin digunakan
dalam banyak laboratorium.
Medium
pemisahannya berupa lapisan setebal 0,1-0,3 mm padat adsorben pada lempeng
kaca, plastic atau aluminium. Lempengan yang lazim berukuran 20x5 cm. Zat padat
yang lazim adalah alumina, gel silika dan selulosa. Dulu peneliti mempersiapkan
lempengnya sendiri dengan menyalut kaca itu denggan suspensi air dari zat padat
itu, yang biasanya mengandung zat pengikat sepertiplester paris, dan kemudian
mengeringkan lempeng-lempeng itu dalam oven. Lempeng kaca dan lembar plastik
ataupun aluminium yang telah dilapisi sebelumnya dapat dipotong-potong dengan
gunting keukuran yang diminati.
Langkah pertama
yang kami lakukan yaitu menyiapkan alat dan bahan yang dibutuhkan. Sampel
berupa daun mengkudu disiapkan sebanyak 100 gram dan diiris sampai halus.
Irisan daun tersebut kemudian
dikeringkan didalam ruangan. Setelah semua irisan daun mengering dilanjutkan
dengan perendaman dengan pelarut methanol. Pelarut methanol sebanyak 500 ml
diisikan dalam botol berwarna gelap yang sebelumnya telah diisikan irisan daun
yang mongering. Hal ini dilakukan selama 3x24 jam dan diguncang tiap 6 jam.
Setelah siap kemudian dipakai untuk sampel pada percobaan kromatografi lapis
tipis.
Disediakan gelas kimia yang diisikan campuran
pelarut yaitu, butanol : CH3COOH : eter : benzena = 1:1:1:4, eter :
metanol= 1 : 1, benzena : CH3COOH= 2 : 1, metanol : benzena= 1 : 3,
eter : CH3COOH= 1 : 3 dan eter : benzena= 1 : 2 . Masing-masing
campuran pelarut tersebut digunakan untuk menguji sampel dengan menggunakan
pelat TLC. Pelat TLC sebelumnya telah dibentuk dengan ukuran 5x1 cm. Kemudian
diberi bats atas dan batas bawahnya dengan jarak 0, cm menggunakan pensil. Alat
yang digunakan haruslah pensil, kerena jika menggunakan pena ataupun spidol,
tintanya akan ikut terjerap. Pelat TLC menggunakan alumina sebagai stasioner.
Kemudian larutan sampel diambil dengan menggunakan pipa kapiler dan ditotolkan
pada tengah salah satu batas. Pelat yang telah ditotolkan larutan sampel
dimasukkan secara vertikal atau diagonal pada gelas kimia berisi campuran
larutan pelarut. Lalu ditunggu sampai noda terbawa oleh pelarut dan pelarut
mencapai batas atas. Kemudian diukur jarak yang ditempuh noda dan jarak garis
depan pelarut dan dihitung Rf-nya.
Daun mengkudu
dengan nama latin morinda citrifolia
mengandung senyawa-senyawa yang bermanfaat seperti morindin yang membantu
system kekebalan tubuh. Senyawa scopoletin yang bermanfaat untuk mengatur
tekanan darah, senyawa asam sitrat yang penting dalam metabolisme makhluk
hidup, senyawa asam maleat yang berguna dalam biokimia sebagai inhibitor reaksi
transaminase, senyawa , senyawa gum, beberapa senyawa antioksidan,dll. Ekstrak
daun mengkudu itu dipisahkan dari pelarutnya dengan bantuan campuran pelarut
metanol : CH3COOH : eter : benzena= 1:1:1:4, noda dari sampel
menempuh jarak 3,1 cm dengan noktah berwarna hijau kekuningan, sehingga dapat
dihitung Rf , yaitu:
Rf = Jarak yang ditempuh senyawa
Jarak garis
depan pelarut
= 3,1 / 4
= 0,76
Untuk campuran
pelarut eter : metanol = 1:1, noda menempuh jarak 3,5 cm dengan warna kuning
kehijau-hijauan. Kemudian dihitung Rf-nya sebagai berikut:
Rf = Jarak yang ditempuh senyawa
Jarak garis
depan pelarut
= 3,5 / 4
= 0,875
Untuk campuran
pelarut benzena : CH3COOH = 1:2, noda menempuh jarak 3 cm dengan
warna hijau. Rf yang diperoleh yaitu :
Rf = Jarak yang ditempuh senyawa
Jarak garis
depan pelarut
= 3 / 4
= 0,75
Untuk campuran
pelarut metanol : benzena = 1:3, noda menempuh jarak 3,7 cm dengan noktah
berwarna kuning, yang nilai Rf-nya yaitu:
Rf = Jarak yang ditempuh senyawa
Jarak garis
depan pelarut
= 3,7 / 4
= 0,925
Untuk campuran
pelarut eter : CH3COOH = 2:3, noda menempuh jarak 3,8 cm dengan
noktah panjang berwarna kuning-hijau, dengan nilai Rf yaitu :
Rf = Jarak yang ditempuh senyawa
Jarak garis
depan pelarut
= 3,8 / 4
= 0,7
Untuk campuran
pelarut metanol : CH3COOH= 1:3, noda menempuh jarak 3,5 cm dengan
noktah panjang berwarna hijau, nilai Rf-nya yaitu :
Rf = Jarak yang ditempuh senyawa
Jarak garis
depan pelarut
= 3,5 / 4
= 0,875
Untuk campuran
pelarut eter : benzena= 1:2, noda menempuh jarak 2,8 cm dengan noktah berwarna
hijau-kuning, nilai Rf-nya yaitu :
Rf = Jarak yang ditempuh senyawa
Jarak garis
depan pelarut
= 2,8 / 4
= 0,7
Pada analisis
Rf, data yang diambil adalah dengan jarak noda lebih atau paling mendekati
batas atas. Ini disebabkan karena pelarut tersebut memiliki tingkat kepolaran
paling rendah, bahkan benzena merupakan senyawa non polar. Nilai Rf sebesar
0,925 ini membuktikan bahwa sifat eluen yang non polar lebih mudah termigrasi
pada bahan fase diam seperti silika gel yang polar. Urutan campuran eluen
berdasarkan kenaikan nilai Rf yaitu eter dan benzene yaitu 0,7 ; eter dan asam
asetat yaitu 0,7 ; benzena dan asam asetat yaitu 0,75 ; eter dan metanol juga
metanol dan asam asetat yaitu 0,875 ; dan metanol dan benzena yaitu 0,925.
IX. Diskusi
Pada percobaan
ini kami melakukan percobaan kromatografi lapis tipis dengan menggunakan sampel
yang sebelumnya telah dimaserasi. Sampel yang digunakan adalh mengkudu dengan
nama latin morinda citrifolia yang
mengandung senyawa morindin, scopoletin, asam maleat, asam sitrat, senyawa gum
dan senyawa antioksidan lainnya. Proses penyarian simplisia menggunakan pelarut
metanol sebanyak 500ml dengan sampel dau kering sebanyak 100 gram. Sampel dan
pelarut ditempatkan dibotol berwarna gelap dengan beberapa kali pengocokan dan
pengadukan pada temperature kamar. Keuntungan pemroses sampel dengan maserasi
adalah pengerjan dan alat yng digunakan sederhana dan kerugiannya yaitu waktu
pengerjaan yang lama dan membutuhkan pelarut dengan volume besar, juga
penyarian kurang sempurna.
Kromatografi
pada dasarnya adalah metode pemisahan berdasarkan proses migrasi dari
komponen-komponen senyawa diantara dua fase, yaitu fase diam dan fase gerak.
Fase gerak membawa zat terlarut melalui media fase diam sehingga terpisah dari
zat terlarut lainnya yang terelusi lebih awal atau paling atau paling akhir
karena perbedaan afinitas masing-masingzat terlarut dengan fase diam. Fase diam
disini adalah berupa zat padat yang disebut adsorben yang digunakan adalah
pelat TLC silika gel tipe F254 dengan rumus kimia SiO2.H2O.
Silika gel merupakan penjerap yang paling banyak digunakan dalam kromatografi
lapis tipis. Senyawa netral yang merupakan gugusan sampai tiga pasti dapat
dipisahkan pada lapisan yang diaktifkan dengan memakai pelarut organik atau
campuran pelarut yang normal. Karena sebagian besar silika gel bersifat sedikit
asam, maka asam agak mudah dipisahkan, jadi meminimumkan reaksi asam-basa
antara penjerap dengan senyawa yang dipisahkan. Sedangkan fase gerak yang
sering digunakan adalah berupa campuran dari pelarut organik dengan tujuan
untuk memperoleh pemisahan yang lebih baik. Kombinasi pelarut berdasarkan atas
polaritasnya, sehingga akan diperoleh sistem pengembang yang cocok. Dalam
beberapa percobaan, pelarut tunggal memberikan hasil yang memuaskan, akan
tetapi pada sebagian percobaan pelarut tunggal dapat menggerakkan bercak
terlalu jauh sehingga kombinasi pelarut
yang mempunyai polaritas yang berbeda sering digunakan. Pelarut yang digunakan
dalam percobaan ini adalah butanol, metanol, eter, benzene dan asam asetat
dengan urutan kekuatan elusi sebagai berikut:
Benzene
Eter
Butanol kekuatan
elusi meningkat
Metanol
Asam asetat
Kekeuatan elusi sebanding dengan kekuatan kepolarannya.
Jadi dari benzena sampai asam asetat kepolarannya meningkat.
Campuran yang
akan dikromatografi harus dilarutkan dalam pelarut yang agak non polar untuk
ditotolkan pada lapisan. Pada umumnya dipakai larutan 0,1-1. Hampir segala
macam pelarut dapat digunakan tapi yag terbaik digunakan adalah yang bertitik
didih 50-100 0C. Untuk itu digunakan pelarut metanolyang mudah
menguap pada suhu kamar. Karena metanol merupakan pelarut universal yang mampu
melarutkan senyawa metabolit sekunder dalam tanaman. Ada 2 kekeurangan utama
KLT; pertama yaitu lapisan nisbi tipis
dibandingkan dengan lapisan buatan sendiri karena ukurannya lebih besar. Kedua
, jarak untuk pengembangan lebih kecil, sehingga sampel harus ditotolkan
sekecil mungkin. Penotolan dilakukan dengan menggunakan pipa kapiler. Cuplikan
berupa larutan harus ditotolkan sekitar 8-10 mm dari salah satu garis ujung
batas. Beberapa kali penotolan dapat dilakukan pada tempat yang sama asal
lapisan dibiarkan kering dahulu. Identifikasai dari senyawa-senyawa hasil
pemisahan KLT dapat dilakukan dengan penambahan pereaksi kimia dan
reaksi-reaksi warna. Tetapi biasanya digunakan harga Rf. Harga Rf yaitu :
Rf = Jarak yang
ditempuh oleh senyawa dari titik penotolan
Jarak yang
ditempuh pelarut dari titik penotolan
Harga Rf untuk senyawa murni dapat dibandingkan dengan
haga-harga standar. Harga Rf yang diperoleh hanya berlaku untuk campuran
tertentu dari pelarut dan penyerap yang digunakan. Faktor yang mempengaruhi
nilai Rf yaitu :
1.
Struktur kimia
senyawa yang dipisahkan
2.
Sifat dari
penjerap dan derajat aktivasinya
3.
Tebal dan kerataan dari lapisan penjerap
4.
Pelarut fase
bergerak
5.
Derajat
kejenuhan dari uap
6.
Teknik
percobaan
7.
Jumlah cuplikan
yang digunakan
8.
Suhu
9.
Kesetimbangan
Harga Rf yang diperoleh dari hasil percobaan sesuai dengan
campuran pelarut yang digunakan yaitu metanol : CH3COOH : eter :
benzena (1:1:1:4) adalah 0,76 ; benzena : CH3COOH (2:1) adalah 0,75
; campuran metanol : benzena (1:3) adalah 0,925 ; campuran eter : CH3COOH
(2:3) adalah 0,7 ; campuran metanol : CH3COOH(1:3) adalah 0,875 ;
dan campuarn eter : benzena (1:2) yaitu 0,7.
X. Kesimpulan
Dari percobaan
yang telah dilakukan, dapat disimpulkan bahwa :
1.
Teknik
pemisahan dengan KLT merupakan teknik kromatografi planar dimana zat-zat
dipisahkan berdasarkan perbedaan migrasi zat terlarut dalam fase diam (adsorben
dilapisi silika gel) dan fase gerak (larutan pengembang).
2.
Semakin polar
senyawa organik, semakin kuat ia menjerap molekul air sehingga keaktifannya
menurun.
3.
Hasil dari
pemisahan dengan metode KLT digunakan harga Rf
(retardation factor) dengan rumus :
Rf = Jarak yang
ditempuh senyawa
Jarak garis
depan pelarut
Dan didapat nilai Rf yaitu : 0,76 ; 0,75 ; 0,925 ; 0,875 ; 0,7 ;
0,7
4.
Keakuratan
pemisahan dengan metode KLT tergantung pada pemilihan adsorben sebagai fasa
diam, kepolaran pelarut, ukuran kolom terhadap jumlah material, dan laju fase
gerak
5.
Suatu senyawa
dikatakan murni jika noda yang ditotolkan terjerap, dengan bentuk yang konstan
atau tidak meninggalkan noktah pada jalan yang dilaluinya pada pelat.
XI. Daftar Pustaka
Fessenden. 2003. Kimia Organik. Jakarta : Erlangga
Gritter. 1991. Pengantar Kromatografi. Bandung :
ITB
Soebagio,dkk. 2002. Kimia Analitik. Malang : FMIPA UNM
Tim Kimia Organik. 2013. Penuntun Kimia Organik. Jambi : UNJA
Underwood.2002. Analisis Kuantitatif. Jakarta :
Erlangga
Underwood.2006. Analisis Kuantitatif. Jakarta :
Erlangga
Tidak ada komentar:
Posting Komentar